NIVA Danmark

Home » Nyheder » Digital droplet Polymerase Chain Reaction (ddPCR)

Digital droplet Polymerase Chain Reaction (ddPCR)

Af: Steen W. Knudsen

NIVA har i efterhånden mange år analyseret vandprøver for forekomst af miljø-DNA (Eng.: ‘environmental DNA’, forkortet: ‘eDNA’), både i ferske og marine økosystemer. Bland andet har NIVA Danmark for Miljøstyrelsen i Danmark gennemført MONIS-projektet (’Monitoring of non-indigenous species in marine waters’ 2014-2023).

I forlængelse af MONIS-projektet har NIVA Danmark i maj 2022 erhvervet en såkaldt ‘digital droplet Polymerase Chain Reaction’-maskine (ddPCR-maskine) og fået den installeret i det laboratorium ved Københavns Universitet ved Statens Naturhistoriske Museum som NIVA Danmark benytter sig af for at lave analyser af eDNA.

I NIVA Danmark har vi siden 2017 hvert år analyseret marine vandprøver for tilstedeværelse af DNA fra ikke-hjemmehørende arter. De første resultater fra analyse af eDNA i vandprøver med brug af ‘quantitative Polymerase Chain Reaction’ (qPCR) er allerede videnskabeligt publiceret og kan læses om på (https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.153093).

At søge efter eDNA i vandprøver er baseret på samme PCR-teknik som benyttes for at lede efter COVID i vatpindestrøg fra menneskers slimhinder. Men istedet for at lede efter rester af DNA fra COVID på vatpinde, er NIVA Danmark i fuld gang med at lede efter rester DNA fra ikke-hjemmehørende arter i danske farvande fra hundredevis af marine vandprøver.

Er der eDNA fra en ikke-hjemmehørende art tilstede i en vandprøve, vil PCR-teknikken sørge for at DNA-molekylet vil blive eksponentielt mangedoblet, og dermed muligt at detektere. Er der intet eDNA til stede i en vandprøve, sker der ingen mangedobling.

Med ddPCR-teknikken er denne mangedobling isoleret i tusindvis af enkelte dråber. Indholdet af hver enkelt dråbe kan efterfølgende tælles af en ‘droplet reader’. Hver enkelt dråbe bliver på denne facon et teknisk replikat af vandprøven. Antallet af positive dråber kan så give indblik i hvorhenne i danske farvande der forekommer ikke-hjemmehørende arter.

Som nævnt har NIVA Danmark siden 2017 analyseret vandprøver for indhold af eDNA fra ikke-hjemmehørende arter med brug af quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Denne metode er dog langt mere ressourcekrævende, eftersom tre tekniske replikater hurtigt koster mindst lige så meget som det koster at lave et enkelt rør med tusindvis af dråber i et rør per ddPCR.

Maskinen og metoden med ddPCR er beskrevet her:

Droplet Digital PCR (ddPCR) Technology

Vores mål er på sigt at flytte analyserne af vandprøver med flere tekniske replikater fra den nuværende qPCR-maskine, som kræver flere rør med ekstra reaktioner, over til den nyindkøbte ddPCR-maskine (Figur 1), som i stedet laver mellem 10.000 og 20.000 mikroskopiske dråber i det samme rør. Det bidrager til at gøre målingen af eDNA-molekyler fra de ikke-hjemmehørende arter mere præcis.

Fra december 2022 er det planen at vi i NIVA Danmark skal analysere de samme marine vandprøver med både qPCR- og ddPCR-metoderne for at blive klogere på hvorhenne i de danske farvande der lever ikke-hjemmehørende arter, og hvor store disse arters forekomster er (Figur 2 og 3). På sigt er det planen at alle analyserne gennemføres på ddPCR-maskinen.

For yderligere oplysninger om eDNA og ddPCR: Steen W. Knudsen (steen.knudsen@niva-dk.dk).

Figur 1: Opsætningen med ddPCR involverer to maskiner plus en computer plus en PCR-maskine. Først laves de mere end 10000 dråber med en ‘droplet generator’ (A). Så anbringes pladen med reaktionerne i en PCR-maskine (ikke med på fotografi), hvor det eftersøgte eDNA-fragment kopieres i millioner af kopier i hver sin egen dråbe i reaktionsrøret. Så bringes pladen med reaktionsrør, der hver har tusindvis af dråber, tilbage og med en computer (B) indtastes information om de enkelte reaktionsrør, hvorefter en ‘droplet reader’ (C) afgør hvor mange af de tusindvis af dråber, der indeholder det eftersøgte eDNA-fragment.
Figur 2: Marine vandprøver fra 2021 er allerede blevet analyseret med ‘quantitative polymerase chain reaction’ (qPCR) for eDNA-fragment fra sandmusling (Mya arenaria). De marine vand­prøver fra Miljøstyrelsen har hver deres eget unikke prøvenummer, der kan sammenholdes på tværs af analyser. Farvekoden på den indsamlede lokalitet angiver hvor intenst eDNA-signalet fra sandmusling er. En hvid eller gul firkant kan tolkes som intet eDNA eller et tvivlsomt eDNA-signal. Orange, rød og sort fortolkes som højere koncentration af eDNA fra den eftersøgte art.

Figur 3: Målingerne af eDNA i vandprøver for sandmusling kan sammenholdes mellem de to maskiner. Fordi antallet af tekniske replikater med ddPCR er over 10000, imod de tre tekniske replikater der benyttes for qPCR-analysen, er der nu større præcision i vurderingerne af eDNA i vandprøverne. Antallet af eDNA-molekyler fra sandmusling er vurderet på en logaritmisk skala, og er her sammenholdt mellem ddPCR (grøn) og qPCR (okkergul). De grå og hvide inddelinger angiver forskellige vandprøver indsamlet i 2021, medens de violette inddelinger er målinger på positive kontroller, der tjener til reference. Begge maskiner har en nedre grænse for hvorvidt det kan lade sig gøre at kvantificere antallet af eDNA-molekyler i ekstraktionen fra vandprøven, hvilket her er angivet med vandrette linjer for de to maskiner (grøn og okkergul). Vandprøvernes unikke nummerkode er genbrugt i denne sammenligning mellem ddPCR og qPCR, og er således mulige at genfinde i figur 2.
By in Nyheder on .
%d bloggers like this: